Studie och utvärdering av cancerframkallande

Carcinogenes studeras med olika standardiserade toxikologiska tester. En första del av dessa tester utförs in vitro, och - om de är positiva - fortsätter vi med ett in vivo -experiment. Detta experimentella steg-för-steg-tillvägagångssätt kallas DECISION POINT APPROACH, en sekvens av försök som stannar vid slutet av varje försök för att avgöra hur försöket ska fortsätta. Det finns fem steg:

FAS A: Den cancerframkallande föreningens struktur och egenskaper;

FASB: i denna fas av korttids in vitro-testning används däggdjursceller. De vanligaste cellerna är hepatocyter, eftersom omfattningen av reparationen av skadan som hepatocyten utvecklar beroende på svårighetsgraden av skadan som ämnet orsakat studeras. I ett nötskal bestämmer vi inte skadan i sig, utan hur mycket av reparationssystemet som har aktiverats av levercellen.

Förfarandet som genomförs är att bilda 3 hepatocytkulturer. I den första kulturen är hepatocyterna friska, i den andra behandlas de med testsubstansen och slutligen i den tredje behandlas de med ett kontrollämne som säkert är cancerframkallande.Dessa tre kulturer innehåller en radioaktiv pyrimidinbas, som är tritierad tymidin, som fungerar som en markör.

Om föreningen som undersöks orsakar en mutation i DNA: t, svarar cellen på detta problem genom att aktivera reparationssystemen. DNA -delen som har genomgått mutationen skärs av och tack vare verkan av DNApolymeraset ersätts den saknade delen med en ny. För korrigeringen använder DNApolymeraset de nya baserna, inklusive tritierat tymidin. En radioaktiv bas införlivas. Analysen av radioaktivitet bestämmer mutationsnivån i de behandlade cellerna: ju högre radioaktivitet, desto större DNA -mutationer.

Även i fas B tester utförs också på bakterier, för att kunna studera om det finns några omvända mutationer. De bakterier som används är salmonella som redan bär mutationer. Mutationen gäller syntesen av histidin, så salmonella kan inte växa utan histidin. Dessa bakteriekolonier tas delvis för att behandlas med testämnet, dels för den negativa kontrollen och dels för den positiva kontrollen, för att sedan testas med ett känt cancerframkallande ämne. Om detta testämne är indirekt genotoxiskt måste metaboliserande enzymer införas i odlingsmediet. Vid denna tidpunkt finns det 3 kulturer som kommer att sås och odlas i petriskålar (det finns inget histidin i odlingsmediet). Om det inte har varit några mutationer av det cancerframkallande ämnet som ska testas, borde det i teorin inte finnas några på plattorna Om det fanns en mutagen verkan av det cancerframkallande ämnet kan det ha förändrat den första mutationen och skapat en andra mutation som kan växa bakterierna på det histidinfria odlingsmediet. I detta fall den andra mutationen att den modifierar den första mutationen och tar namnet RETROMUTATION Slutligen, om en signifikant tillväxt inträffar i piasta petri, är cancerframkallande direkt.
Alltid med ett in vitro -test är det möjligt att bestämma den kromosomala integriteten. Detta test utförs alltid på däggdjursceller och används för att testa giftiga ämnen som kan orsaka mutationer på vissa enzymer som är ansvariga för biosyntesen av DNA. Det ämne som ska testas genomgår in vitro -analys För att kunna avgöra om ämnet som undersöks påverkar integriteten och antalet närvarande kromosomer används mikronukleustestet. Mikrokärnorna är blåsor som bildas med en del av kromatinet inuti. Kromatinet som ingår i dessa mikrokärnor kan antingen vara hela kromosomer eller fragment av kromosomer. Mikrokärnorna bildas genom fel celldelning som ger upphov till dotterceller med genetiskt material inte lika Resultatet av detta test kommer att vara bestämning av ämnen som definieras som klastogena och spindelgifter.Den klastogena substansen producerar mikronkärnor med acentriska kromosomfragment så att ämnet inducerar ett avbrott i kromosomerna, istället producerar spindelens giftämne av mikrokärnorna som inne i det finns hela kromosomer.
Om ämnet som undersöks inducerar gentoxicitet i ett eller flera tester definieras detta som mycket misstänkt, så det går direkt till fas D. Om det testade ämnet å andra sidan inte ger någon genotoxisk effekt, går det över till studiefas C eftersom det kan vara en promotor.

FASEC: i denna fas kan både in vitro och in vivo test utföras.

För in vitro-test kan det påvisas att promotorsubstansen kan bryta klyftorna mellan normala celler och tumörceller, med följd av passage av ämnen mellan de två cellerna.

Ett in vivo -test är induktion av hudtumörer hos möss. Det ämne som ska testas appliceras två eller tre gånger i veckan på musens hud. Inom 2/3 månader om detta ämne är en promotor kan det finnas papillombildningar. Hos möss beaktas två huvuddata: antalet möss som påverkas av papillom och antalet papillom som finns på varje djur. Om ämnet fungerar som en promotor och utvecklar en tumör hos den behandlade musen betyder det att det verkligen är ett ämne med en promotoreffekt.

När dessa tester är klara går vi vidare till långsiktiga in vivo-test.

FASERAD: i denna fas testas alla föreningar som visar sig mutagena och alla föreningar som inte visar sig mutagena. De tester som kan utföras är olika, varav några är tester som utförs på levern, på lungan och slutligen på bröstet.

Leverprovet visar inte bildandet av en nybildad tumör, utan av ett neoplastiskt fokus, därför något som förbereder sig för att bli en tumör. Cellerna i detta fokus är redan atypiska celler, därför har de genomgått en mutation och förbereder sig för att bli neoplastiska celler. Efter en viss tid, tack vare obduktionsundersökningen, bestäms bildandet av pre-neoplastiska fokus genom att beräkna antalet och omfattningen av dessa pre-neoplastiska formationer.

Lungtestet möjliggör bestämning av ett adenom, vilket är en "anomali hos lungvävnadens celler. Även i detta fall undersöks lungvävnaden hos råtta efter ganska lång tid (månader) (dessa adenom är lätt identifierbara eftersom är vitaktiga knölar på lungepitelet).
Bröstprovet möjliggör bestämning av tumörer i körtelvävnaden. Antalet bildade adenom och antalet djur som presenterar adenom utvärderas alltid.

Om det finns positiva resultat från dessa test är testämnet verkligen cancerframkallande. Vid denna tidpunkt går vi vidare till att genomföra dyra tester med mycket långa körningstider.

FASE: i denna fas genomgår ett varierande antal djur, från 20 till 50, långsiktiga tester. Dessa tester är mycket dyra och tar lång tid att få vissa resultat. vi talar om ungefär 1/8 av djurets liv. Det är möjligt att vissa djur dör under dessa tester, men de studeras alltid med en obduktion och histologisk typundersökning. De valda djuren är alltid råttor och möss och endast 70-80% överlever tills slutet av de långsiktiga testerna. Djuren som används är bara avvänjda, eftersom ju yngre de är desto känsligare är de för behandlingar. Under den långsiktiga testperioden stöds forskaren alltid av en matematiker-statistiker, som kan ta hänsyn till all insamlad information och reproducera de olika uppgifterna.

Doserna som testats på djur utgår från den högsta tolererade dosen och alla dess submultiplar, och dos-responsreaktionen hos djuret utvärderas.
Administrationen måste alltid närma sig den väg genom vilken mannen kan komma i kontakt med ämnet som undersöks, därför den orala, kutana eller andningsvägen, medan om ett läkemedels cancerframkallande egenskaper testas är det också användbart att utföra intravenös administrering.
Grupperna av djur som testas är 4 (50 djur för varje grupp):

En NAIF -grupp som inte har någon behandling;
En grupp behandlad med fordonet;
En grupp behandlad med testämnet;
En grupp behandlad med ett känt cancerframkallande ämne.

Det är mycket viktigt att antalet djur i varje grupp är så lika som möjligt. Om det är för stor skillnad i antalet djur kan det statistiska testet visa sig vara falskt.
De utvärderingar som görs är:

Total tumörfrekvens;
Frekvens av vissa tumörer;
Djurfrekvens med mer än en typ av tumör;
Antal djurcancer.

I slutet av alla dessa studiefaser klassificeras ämnet i en rangordning som fastställts av IARC (International Agency for Research and Development on Cancer) och av Environmental Protection Agency (EPA).